Identificação e caracterização de análogo de gene de resistência (RGA) envolvido na interação cafeeiro-Hemileia vastatrix

Abstract

A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é considerada a principal doença dessa cultura, sendo responsável por perdas na ordem de 30 a 50% da produção, caso medidas de prevenção e controle não sejam adotadas. Apesar da eficiência dos fungicidas, o uso de variedades resistentes é a melhor alternativa para o controle da doença por ser eficiente, econômico e sustentável. No entanto, a obtenção de cultivares com resistência durável tem sido um constante desafio para os melhoristas, devido ao surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem compreendido, informações acerca da interação com o hospedeiro são escassas. Estudos de genômica funcional tem contribuído para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação planta-patógeno, assim como para a identificação de genes codificadores de proteínas envolvidas nas vias de resposta de defesa da planta. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi a identificação e caracterização de um Análogo de Gene de Resistência (Resistance Gene Analog - RGA) potencialmente envolvido na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Para isso, um RGA candidato foi selecionado a partir de dados do transcriptoma da interação cafeeiro-H. vastatrix raça XXXIII, com o potencial envolvimento no mecanismo de defesa da planta. A análise de expressão gênica do RGA mostrou diferença significativa entre variedades resistente e suscetível. Foi realizado o rastreamento do RGA em uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome) obtida do Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2. O sequenciamento do clone BAC e a sua análise estrutural revelou um loco gênico altamente similar a um loco do genoma de Coffea arabica. Foram identificados três RGAs e as análises de filogenia utilizando esses genes confirmaram a similaridade dessa região com os genomas disponíveis de C. arabica. Para identificar qual dos três RGAs possui importância na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix, primers específicos para cada RGA foram construídos e utilizados para amplificação de DNA de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e para análises de expressão gênica em genótipos resistentes e suscetíveis. Os três RGAs foram amplificados em todos os cafeeiros diferenciadores de raças. Assim, a diferença entre os genótipos resistentes e suscetíveis poderia estar no nível de expressão desses genes. Análises de expressão mostraram que o RGA4 possivelmente é o gene que mantém a função envolvida com a resistência do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Além disso, os resultados de expressão corroboram com a ideia de resistência pré-haustorial sugerida para a mesma interação. Palavras-chave: Bioinformática. Ferrugem do cafeeiro. Fungos fitopatogênicos. Relações hospedeiro-parasito. Resistência.

Coffee rust, caused by biotrophic fungus Hemileia vastatrix, is considered the main disease of this crop, being responsible for losses in the order of 30 to 50% of production, if preventive and control measures are not adopted. Despite the effectiveness of fungicides, the use of resistant varieties is the best alternative for disease control because it is efficient, economical and sustainable. However, obtaining cultivars with durable resistance has been a constant challenge for breeders due to the emergence of new pathogen races capable of supplanting resistance. Although the H. vastatrix infectious process is well understood, information about host interaction is scarce. Functional genomics studies have contributed to the understanding of the molecular mechanisms involved in plant-pathogen interaction, as well as to the identification of protein coding genes involved in plant defense response pathways. Thus, the objective of this work was the identification and characterization of a Resistance Gene Analog (RGA) potentially involved in the defense response of the coffee to H. vastatrix race XXXIII. For this, a candidate RGA was selected from data from the transcriptome interaction coffee-H. vastatrix race XXXIII, with the potential involvement in the plant's defense mechanism. The analysis of RGA gene expression showed a significant difference between resistant and susceptible varieties. The RGA was screened in a library of BAC clones (Bacterial Artificial Chromosome) obtained from the Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2. The sequencing of the BAC clone and its structural analysis revealed a gene locus highly similar to a locus in the Coffea arabica genome. Three RGAs were identified and phylogeny analyzes using these genes confirmed the similarity of this region with available C. arabica genomes. In order to identify which of the three RGAs has importance in the defense response of coffee to H. vastatrix, specific primers for each RGA were built and used to amplify the DNA of differentiating clones of the H. vastatrix races and for analysis of gene expression resistant and susceptible genotypes. The three RGAs were amplified in all the differentiating coffee clones. The result indicates that the difference between resistant and susceptible genotypes could be in the level of expression of these genes. Expression analyzes suggested that RGA4 is possibly the gene that maintains the function involved with coffee resistance to H. vastatrix race XXXIII. In addition, the expression results corroborate the idea of pre-haustorial resistance suggested for the same interaction. Keywords: Bioinformatics. Coffee rust. Phytopathogenic fungi. Host-parasite relationships. Resistance.